想要在快速分离的同时保证PBMC的得率和纯度，需要注意一下几个方面：

一．抗凝剂的选择：

若后续需要进行ELISPOT实验以及细胞培养实验，采血时需要选择肝素抗凝剂，因为EDTA抗凝剂通过螯合钙抑制凝血，螯合钙可能在抗原特异性再刺激过程中损害细胞因子分泌。

二．最佳分离温度

包括分离管在内的分离产物的最佳分离温度为（20±5）℃。当温度过高时，主要由蔗糖组成的分离液密度会降低，一些淋巴细胞会进入分离层；如果温度过低，主要由蔗糖组成的分离溶液的密度会增加，红细胞在低温下也会减少聚集。因此，与室温条件相比，红细胞难以沉淀在分离溶液层下方，并且容易混合到PBMC层中。因此，在分离过程中，有必要确保血样和分离管都处于室温。

三．冷藏血分离注意事项

如果使用冷冻血液进行分离，PBMC层中的红细胞通常会更多，PBMC的活性会受到一定影响。建议在分离前将血样恢复到室温，并适当延长离心时间，例如30分钟。需要注意的是，如果血液样本冷藏很长时间，即使血液样本已经恢复到室温，离心时间已经延长，分离效果也无法与新鲜血液样本相比。建议将血液储存在室温下，储存时间不超过2小时。

四．血样用量

利用红细胞将原本位于管底的分离液置换到红细胞上方，分离液则将密度相对较小的PBMC和血浆顶到筛板上方，而血液中的红细胞数量是固定的，如果血液的用量太少，则分离后红细胞的置换效果差，PBMC可能会紧贴分离管中的筛板，难以吸出，此时即使稀释血样也无法改善分离效果。也因此红细胞沉降液并不推荐搭配分离管使用，沉降处理后红细胞量变少，置换效果差。

如果血液的用量太多，则可能导致红细胞超过筛板，PBMC层模糊、分离效果下降。综上，15mL分离管的血样推荐用量为3mL~6mL；50mL分离管的血样推荐用量为15mL~25mL。

五．取出PBMC的方法

使用分离管分离出PBMC后，可以选择直接倒出或吸出PBMC，若需要相对更高的细胞得率，可选择直接倒出筛板上方的液体；若需要相对更高的细胞纯度，可选择巴氏吸管或移液枪吸出PBMC。

六．使用什么方式进行PBMC计数

AO/PI：可以将有核的活细胞和有核的死细胞分开计数，且红细胞不染色，其中AO可以通过完整的细胞膜，嵌入所有细胞（活细胞和死细胞）的细胞核，呈现绿色荧光；PI只能通过不完整的细胞膜，即死细胞的细胞膜，嵌入所有死细胞的细胞核，呈现红色荧光。此时活/死PBMC可呈现荧光信号。而成熟的红细胞及血小板，因为没有细胞核，不能被AO/PI染色，因此可以完全被排除在外不被计数。

乙酸亚甲基蓝：3%乙酸亚甲基蓝可以计数有核细胞，但不能区分死活细胞。其中3%乙酸可以破坏细胞膜；亚甲基蓝可以结合核酸，使细胞核染色。细胞计数过程中所有细胞的细胞膜都会被裂解，但红细胞没有细胞核所以不会被计算在内。虽然3%乙酸亚甲基蓝计数法不能区分死活细胞，但一般来说红细胞会比死细胞多，所以这个计数法也可以使用。

台盼蓝：正常活细胞细胞膜结构完整，台盼蓝不能进入细胞内，活细胞呈透明状；通常细胞膜完整性丧失时，即可认为细胞已经死亡，因此对于死细胞或细胞膜不完整的细胞来说，细胞膜通透性增加，台盼蓝可以进入细胞内，把细胞染成蓝色，所以台盼蓝可以区分活死细胞，但不能区分红细胞和有核细胞。

泰克生物具有成熟的动物PBMC分离技术，保证细胞分离过程中不受损害、不被刺激，后期的纯化技术保证骆驼单个核细胞的纯度以及活率等技术指标，适用于后期的细胞培养、抗体制备等其他研究。

文章来源：

1、密度梯度离心法分离PBMC操作流程 - 百度文库 (baidu.com)

2、PBMC分离相关问题-PBMC分离相关问题-泰克生物 (tekbiotech.com)